细胞培养标准操作流程

一、前期准备
 
1. 实验环境准备：对细胞培养室进行清洁消毒，开启超净工作台紫外灯照射30分钟以上，照射结束后关闭紫外灯，通风15-20分钟。同时检查培养箱、离心机、倒置显微镜等设备，确保其参数正常（如培养箱温度37℃、CO₂浓度5%）。
2. 试剂与耗材准备：提前将培养基、血清、胰酶、PBS缓冲液等试剂从冰箱取出，置于室温下平衡至室温（或按试剂要求进行预热）。培养瓶、离心管、移液管等耗材需经灭菌处理，确认无破损、污染后备用。
3. 个人防护：实验人员穿戴无菌实验服、手套、口罩，规范进行手部消毒，避免人为污染。
 
二、细胞复苏（若使用冻存细胞）
 
1. 从液氮罐中取出冻存管，迅速放入37℃恒温水浴锅中，快速摇晃使管内冻存液在1-2分钟内完全融化。
2. 融化后的细胞悬液转移至含有预热培养基的离心管中，轻轻吹打混匀，以1000-1200rpm的速度离心5-8分钟。
3. 离心结束后，弃去上清液，加入适量新鲜培养基，用移液管轻轻吹打细胞沉淀，使其分散成单细胞悬液。
4. 将细胞悬液转移至无菌培养瓶中，补充适量培养基，轻轻摇匀后放入培养箱中培养，次日观察细胞贴壁及生长情况。
 
三、细胞传代
 
1. 观察细胞：通过倒置显微镜观察培养瓶中的细胞，当细胞汇合度达到80%-90%时，即可进行传代。
2. 清洗细胞：弃去培养瓶中的旧培养基，加入适量PBS缓冲液，轻轻摇晃培养瓶，清洗细胞表面残留的培养基及血清，随后弃去PBS缓冲液，重复清洗1-2次。
3. 消化细胞：向培养瓶中加入适量胰酶消化液，确保消化液均匀覆盖细胞表面，置于37℃培养箱中孵育1-3分钟，期间可通过显微镜观察细胞形态变化，当细胞变圆、间隙增大时，立即加入适量含血清的培养基终止消化。
4. 吹打分散：用移液管轻轻吹打培养瓶壁上的细胞，使细胞完全脱落并分散成单细胞悬液，避免用力吹打导致细胞损伤。
5. 离心分装：将细胞悬液转移至离心管中，1000-1200rpm离心5-8分钟，弃去上清液，加入新鲜培养基重悬细胞。根据实验需求，将细胞悬液分装至新的培养瓶中，补充培养基后摇匀，放入培养箱继续培养。
 
四、细胞换液
 
1. 当培养基颜色变为黄色（pH值下降）或细胞生长至一定阶段时，需进行换液。
2. 打开超净工作台，取出培养瓶，轻轻倾斜培养瓶，使旧培养基汇集在一侧，用移液管缓慢吸弃旧培养基。
3. 加入适量PBS缓冲液清洗细胞1次，弃去PBS后，加入预热的新鲜培养基，摇匀后放入培养箱中继续培养。
 
五、细胞收集与处理（根据实验需求）
 
1. 若需收集细胞，按细胞传代步骤进行消化、终止消化及离心，获得细胞沉淀。
2. 对细胞沉淀进行后续处理，如加入细胞裂解液提取蛋白、加入固定液进行染色观察，或用于其他实验操作。
 
六、实验后整理
 
1. 及时清理超净工作台，将使用过的耗材分类处理（如污染耗材进行灭菌后丢弃，可重复使用耗材按规定清洗灭菌）。
2. 关闭实验设备，记录细胞培养情况（如细胞种类、代数、生长状态、操作内容等），确保实验数据完整可追溯。
3. 再次清洁培养室环境，保持实验区域整洁，为后续实验提供无菌条件。