支原体qPCR检测——Venor Gem qEP的使用前准备

支原体检测的应用

支原体是细胞实验中，常见的一类污染物。

在干细胞治疗、免疫细胞治疗、CAR-T、抗体药生产、疫苗生产相关的等临床临床项目，以及细胞典藏等重大的细胞培养项目，都需要进行支原体放行检测，以确保产物没有支原体污染。

因此，需要建立结果准确、灵敏度高、操作简便快捷、通过《药典》方法验证的检测手段。

产品名称：支原体qPCR检测试剂盒 (经典法)

英文：Venor®Gem qEP    

货号：11-9025    

品牌：Minerva Biolabs®    

规格：25次/盒    

特点：遵循欧洲药典和日本药典检查的流程，通过方法学验证；灵敏度高；特异性强，操作便捷。

 

产品用途

 

德国Minerva Biolabs公司的Venor® GeM qEP kit，用于定量检测细胞培养物，及其他生物基质中的柔膜体纲微生物，如支原体、无胆甾原体、螺原体。

作用原理

 

通过扩增16S rRNA编码区特异性检测支原体，而真核生物和其他细菌DNA不能通过Venor®GeM qEP Kit扩增。

 

试剂盒包含所有必要的PCR组分，内控DNA可用于鉴定PCR抑制，或DNA抽提问题带来的假阴性。内控DNA可直接加到PCR预混液里，或加到DNA抽提之前的样本中。它可用于验证DNA抽提和qPCR扩增过程。它可从Minerva厂家购买（货号11-9905）。内控对照的扩增结果在560nm检测（HEX通道），而支原体的扩增在520nm检测（FAM通道）。

试剂盒包括dUTP，它替代dTTP，方便用尿嘧啶DNA糖基酶（UNG）监视假阳性。该试剂盒不包含UNG。

 

实验前准备

 

一、细胞培养筛查

细胞应长满90%以上。细胞上清可直接用于支原体检查，无需再样品制备。但上清中可能累积抑制PCR的物质，此时有必要进行DNA抽提。未有证据表明，细胞培养基中的青链霉素存在抑制支原体或影响检测的灵敏度的情况。

细胞培养中的支原体数量平均为1×10^6/ml，至多为1×10^8/ml，足以满足PCR的检测要求。PCR的模板制备如下：

1.转移500μl细胞培养上清至1.5ml EP管，盖紧盖。

2.样本孵育95℃10分钟。

3.样本最大转速离心（15s）以沉淀细胞碎片。

4.取2μl直接用于qPCR，或样品储存在4℃，最多6天。长期保存在-20℃。

 

二、符合药典的样品检查

1、浓缩样品（可选步骤）

样品基质可能对检测方法的灵敏度有至关重要的影响。进一步提高检测灵敏度的一种方法是收集和筛选比支原体DNA提取所需的更大样本量的细胞培养上清(例如，Venor®GeM样品制备试剂盒>200 μl)，并执行样品浓缩步骤。

①转移≤1ml样品上清至1.5ml离心管。

②离心≥10000 × g 15分钟（或≥13000× g  6分钟），以沉淀支原体颗粒。

③弃掉上清，用200ml Tris缓冲液（10mM Tris-HCl，pH8.4）重悬沉淀。

④样本涡旋混匀，然后直接进行样本稳定化处理或DNA抽提。

 

2.样品稳定化

细胞培养样品可能含有高浓度的DNA酶，即使在较低的温度下也会降解支原体DNA。因此，我们建议采取以下步骤来稳定样品。如果在样品采集后立即进行DNA提取，则不需要此步骤。请注意，在样品浓缩步骤之前，不能通过热失活来稳定样品。

①转移500ml细胞培养上清至1.5ml离心管。盖上管盖。

②95℃孵育10分钟。

③最大速度进行样本离心（15秒），以沉淀细胞碎片。

④样本即可用于DNA抽提，或储存在4℃，最多6天。长期保存在-18℃以下。

 

3.DNA 抽提

大量证据表明，DNA抽提可实现最高的灵敏度。DNA抽提有多种方法，但应适合支原体基因组。我们推荐：

Venor®GeM Sample Preparation kits （货号56-1010/-1050/-1200) 适合手动DNA抽提。

这些DNA抽提试剂盒已经过大量验证，具体流程参见试剂盒说明书。

 

注意事项

由于细胞团块对PCR反应的负面影响，不能直接使用细胞团块进行检测。因此，细胞团块，或其他生物材料，如疫苗、冷冻储存和石蜡包埋的样品，需要在PCR前提取DNA。

已知样品中胎牛血清(FCS)含量(> 5%)会增加PCR抑制的可能性。为了避免假阴性结果，这些样品可能需要在PCR之前，也需要进行DNA提取。

Venor®GeM qEP试剂盒与Venor®GeM样品制备试剂盒(Cat：No. 56-1010/-1050/-1200)用于支原体DNA提取

样品浓缩步骤只适用于完整的支原体细胞。因此，应避免在样品浓缩之前进行“样品稳定”，即不能再浓缩前进行任何破坏细胞的程序(如热失活)，请参见“2.样品稳定化”。可直接处理体积为200 μl的样品，无需浓缩步骤。

 

Venor®GeM qEP kit包含的内控DNA对照，也用于验证DNA抽提步骤。

 

样本浓缩时不要加内控DNA。

 

内控DNA可单独购买（货号11-9905）。

 

PCR抑制可能因样本基质或者洗脱液产生。因而我们推荐Venor®GeM Sample Preparation kit用于DNA制备，其他品牌试剂盒需要经过试验以保证合格。