从以往PCR对支原体污染的检测报道看方法验证的必要性

以PCR为代表的核酸扩增技术自1988年发明以来，已广泛应用于科研和临床，但用于生物制药则较晚，这是因为标准化的建立需要一定的时间。

 

国外已有不少药厂将PCR或qPCR用于工业放行检测中的支原体检查。PCR的灵敏度、特异性、适用性和可靠性具有达到药典标准的潜在可能。但需要按步骤和程序开展方法验证。

 

有作者指出，有些PCR法在反应条件及引物设计上，仍需不断改良以提高其检测效率。作者曾用半巢式PCR检测70份支原体污染的样本（主要为生物制品生产用细胞基质），结果只检出60份，说明PCR要应用于工业检测支原体，其首要因素是要提高检测限。见2015年《生物制品学杂志》中的《中国生产用细胞基质污染支原体类型的分析及猪鼻支原体特异性检测方法的初步建立》。

 

需要指出的是，对于工业药厂，如要采用PCR方法进行支原体污染的检查，如方法需要验证，可使用minerva biolabs提供的现成的支原体标准品。如简化验证，可使用现成的已经过验证的支原体PCR或qPCR检测试剂盒。并且支原体DNA需要经过抽提才能进行检测，以保证相应的灵敏度。

下面小编介绍一下商业试剂盒的特点：

 

1）使用灵活

    *  与几乎所有商用循环仪兼容

    *  可选择常规PCR或实时荧光定量PCR

 

2）高性能

    *  高耐用性、高灵敏度和高特异性（>100种支原体物种可检测）

    *  符合EP 2.6.7 / USP <71> / JP G3标准。提供内部扩增对照，

          用于过程监测。有产品验证报告

 

3）使用方便

   *  预先分装PCR mix（25个反应），保证长期稳定性

   *  组分为冻干粉形式，使运输与存储更简单

   *  探针检测，结果清晰（qPCR）

 

可考虑的标准品需要经过严格标定。需考虑有国际声誉和质控报告的标准品厂家。下面介绍某厂家标准品类别如下：

配套用于过程验证和检测的标准品（EP2.6.7/USP<71>/JP G3）：

*  10CFU™灵敏度标准品，包括所有EP和JP列举的支原体物种

*  100CFU™灵敏度标准品

*  支原体和细菌基因组DNA（特异性验证用）

*  PCR定量标准品（10⁸拷贝DNA/管）

 

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