支原体 qPCR 检测金标准

药典对生物药厂的细胞种子批、病毒收获液及细胞治疗产品等都规定要求不含支原体。它是保证生物制品安全和质量的重要指标之一。但传统支原体检查方法如培养法和 DNA 染色法都存在一定的局限，如所需时间长，操作较为复杂（培养法），存在假阳性和假阴性的情况（特别是染色法）。支原体核酸检测法（包括常规 PCR 和 qPCR）以其检测时间短（仅需 2-3 小时）、灵敏度好和特异性高、操作简单而广受青睐。

目前国内外药厂放行检测及方法验证（product release testing）采用的较多的是支原体 qPCR 检测试剂盒（经典法) 和支原体常规 PCR 检测试剂盒（经典法）。其中，支原体 qPCR 检测试剂盒，由于无须跑胶，且能定量，因而更受欢迎。



支原体 qPCR 检测试剂盒（经典法）被称为支原体检测的金标准，主要基于以下几个原因：

1. 遵循欧洲药典和日本药典要求。德国 MB 公司对该试剂盒进行了全面的验证，包括灵敏度、特异性和耐用性，并提供有验证报告，符合欧洲药典（EP 2.6.7）和日本药典（JP G3）规定，因而可替代传统的培养法和染色法。以灵敏度和特异性为例。

经典法 qPCR 试剂盒对以下欧洲药典规定的 9 种支原体的最低检测限均达到≤10CFU/ml

经典法 qPCR 试剂盒一次检测可涵盖所有可能污染细胞的支原体物种（涵盖欧洲药典规定的 9 种支原体），而对细菌和真核细胞 DNA 没有交叉反应（见下表）。



2. 经典法 qPCR 试剂盒含 qPCR mix、阳性支原体 DNA 对照、内控 DNA 对照，均为冻干粉，稳定性强，复溶后即可使用。内控 DNA 对照，可监测支原体 DNA 抽提过程，以及是否存在 PCR 抑制导致的假阴性。

3. 欧洲和日本药典要求核酸法需包括样品的 DNA 抽提，再行支原体检测。

德国 MB 公司的支原体 DNA 提取试剂盒，具有极好的抽提效果，即使痕量支原体（如 10CFU）提取 DNA 后也可检测出来。在用于工业放行检测时，经典法 qPCR 试剂盒与该试剂盒配合使用。

4．德国 MB 公司提供有全面的标准品，用于支原体核酸法的方法验证。

包括 10CFU 和 100CFU 支原体灵敏度标准品（用于灵敏度和耐用性验证）、支原体基因组 DNA 和细菌基因组 DNA（10ng / 管，用于特异性验证）、qPCR 绝对定量标准品（1X108 基因组拷贝，用于绘制标曲和绝对定量）。其中支原体灵敏度标准品还提供有 GU：CFU 比值（支原体基因组 / 菌落数比值），便于二者的换算。

德国 MB 公司的经典法 qPCR 试剂盒兼容许多品牌的 qPCR 仪，为双通道检测：支原体检测用 FAM 通道，内控对照用 HEX 通道。如仪器没有 HEX 通道，也可选 VIC 通道。具体设置请参考厂家的仪器设置文件。

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